Вы - новичок

и хотите больше узнать о движении или вступить в него

Вы - активист

и вас интересует жизнь движения

Вы - инвестор

и вы заинтересовались проектами движения и возможностью финансирования

Вы - журналист

и ищете информацию или хотите взять интервью

Многомерная биология XXI века и клиническая лабораторная диагностика

Дата опубликования статьи: 24.07.2008

 

…время разбрасывать камни,
и время собирать камни...
Екклезиаст, 3:5

 

Одна из главных задач XXI века – остановить пандемическое распространение болезней цивилизации: сердечно-сосудистых, ишемической болезни сердца, диабета, метаболического синдрома, онкологических заболеваний. Что должна сделать лабораторная диагностика для решения этой задачи? Во-первых, уметь своевременно определять генетическую предрасположенность к возникновению наиболее серьезных патологий. Как становится все более очевидным, многие такие патологии могут вызваться мутациями. Во-вторых, с высокой достоверностью определять количественный показатель риска возникновения патологий, когда они еще находятся в клинически бессимптомном состоянии. Это позволит проводить мероприятия, предупреждающие развитие заболеваний. И, в-третьих, за счет динамического измерения новых биомаркеров проводить отслеживать реакции организма на терапию и на хирургическое вмешательство. Эти задачи уже успешно решаются. И происходит это благодаря революционным достижениям биологии XXI века – ее назвали многомерной биологией (high dimensional biology). В нее входят:


Геномика – идентификация всех генов человека и нарушений в них, приводящих либо к наследственным заболеваниям, либо к предрасположенности к ним.

Транскриптомика – идентификация всех матричных РНК, кодирующих белки, определение количества каждой индивидуальной мРНК, определение закономерностей экспрессии всех генов, кодирующих белки.

РНомика – идентификация всех не кодирующих РНК, определение количества каждой индивидуальной нкРНК – определение закономерностей экспрессии всех нкРНК.

Метаболомика – идентификация и количественное определение всех метаболитов, синтезируемых (или находящихся) в данных клетках, тканях, органах и в биологических жидкостях.

Биоинформатика – использование вычислительной техники, математики и информационной теории для анализа и моделирования молекулярно-биологических систем, в особенности систем, состоящих из генов, РНК, белков и метаболитов и др. Создание баз данных.

Именно эти направления, для краткости называемые «-омиками» (omics – genomics, transcriptomics и т.д.), считаются основой медицины ХХI века.

Клиническая геномика и клиническая транскриптомика. Транскрипционные профили патологий.

Реализация проекта «Геном человека» позволяет обнаруживать мутации в генах, приводящие к наследственным заболеваниям или к повышению вероятности возникновения многих патологий, таких, например, как онкологические, сердечно-сосудистые (атеросклероз), диабет, метаболический синдром, шизофрения и др. В практику лабораторной диагностики уже успешно внедрены методы идентификации мутаций, наиболее часто приводящих, например, к различным раковым заболеваниям. Эти методы основаны на применении ПЦР (полимеразной цепной реакции) и маркерных генов, содержащих нарушения, приводящие к конкретным патологиям. Развитие геномики патологий позволяет, однако, не только проводить их молекулярно-генетическую диагностику, но и, как следующий этап, определять интенсивность синтезов РНК и белков, имеющих отношение к возникновению и развитию заболеваний. Это делается с помощью определения транскрипционных профилей, характеризующих экспрессию всех генов, активных в данном образце.

Технологии, при этом применяемые, основаны на так называемых «ДНК-микрочипах» (DNA microarray). Такой генный чип – это твердая подложка, на которую в определенном порядке нанесены в виде точек индивидуальные гены (их ДНК). Чтобы определить, транскрибируется ли данный ген, на чип помещают (с определенными координатами) лишь его часть – олигонуклеотид. Этот олигонуклеотид соответствует экспрессируемой части гена (экзону). Затем из образца (например, опухоль) выделяется вся (суммарная) РНК. На основе всех молекул РНК данного образца получают их ДНК-копии – кДНК (обратная транскрипция), которые флуоресцентно метят и потом проводят гибридизацию с иммобилизованными на микрочипе олигонуклеотидами. Если в данных условиях какие-то точки с конкретными генами не гибридизуются, это значит, что данный ген не транскрибируется. Если же данная точка микрочипа «светится», значит олигонуклеотиды на этой площадке прогибридизовались с флуоресцентно меченой кДНК, ген транскрибируется.


Чтобы определить, является ли полученный результат ошибкой или нет, проводится сравнение двух объектов. Для этого берут образец А (патология), из него получают суммарную РНК и после обратной транскрипции всех ее молекул флуоресцентно метят (красным) все молекулы кДНК. То же проводят и с образцом В (норма), но метят молекулы кДНК другим цветом (зеленым). Затем проводят гибридизацию ДНК-микрочипа со смесью этих двух препаратов кДНК (конкурентная гибридизация – преимущественно образуют гибриды те молекулы, которых больше). Если сигнал в данной точке на чипе будет красным, значит в клетках А (патология) транскрипция данного гена сильней, чем в клетках В (норма). Если сигнал зеленый, то транскрипция сильнее в клетках В (норма). Если красного и зеленого поровну, то получится желтый цвет. Таким образом, можно сравнивать уровень транскрипции данного гена в разных тканях и органах, в биологических жидкостях при норме и патологии, до терапии и в ее процессе, до хирургической операции и после.

Довольно часто термины «геномика», «транскриптомика» и «протеомика» употребляются в одном и том же значении – для обозначения анализа экспрессии всех генов данного образца – как на уровне синтеза мРНК, так и на уровне синтеза белков (1-3).

Транскриптом – набор всех РНК, находящихся в данном образце. Анализ транскриптома, определение качественного и количественного профиля всех синтезированных РНК, отражает синтез кодируемых ими белков, а так же синтез рибосомальных, транспортных и других РНК. Сравнение транскриптомов нормальных и патологических образцов позволяет идентифицировать новые маркеры, прослеживать изменение их уровней во времени, судить о динамике патологии, об эффективности проводимого лечения и прогнозировать его результат (4-6). Предполагается, что каждая болезнь, характеризуется своим, так сказать, «штрих-кодом» – уникальным паттерном уровней транскрипции набора генов, характерного именно для данной болезни. Разумеется, анализируют транскриптомы не методом «прищуренного глаза», а с помощью компьютерных методов распознавания образов.

Клиническая РНомика

Пожалуй, самой громкой сенсацией биологии конца ХХ стало открытие принципиально нового класса РНК. Практически во всех на этот счет исследованных эукариотных организмах неожиданно было обнаружено огромное количество различных РНК, которые не кодируют белков и не являются ни рибосомальными, ни транспортными. Играют они, в основном, регуляторную роль – влияют на экспрессию генов (чаще всего на уровне трансляции). Это так называемые микроРНК длиной 19-22 нуклеотида. К ним относятся и т.н. короткие интерферирующие РНК (si-RNA), которые выключают синтез определенных белков путем разрушения их мРНК. МикроРНК регулируют экспрессию генов после их транскрипции. Это может происходить за счет:

1) репрессии трансляции мРНК

2) расщепления мРНК

3) ускорения распада мРНК

В каждой микроРНК есть участок, комплементарный особому участку в той мРНК, которая при каких-то обстоятельствах подлежит инактивации. Таким образом, большинство мРНК имеют «черные метки», указывающие на возможность собственной деградации, а микроРНК, имеющие комплементарные участки, в нужный момент узнают «черные метки» и нацеливают на мРНК, приговоренные к ликвидации, предназначенные для этого ферменты и белки. С помощью РНомики содержащиеся в образцах микроРНК идентифицируются, определяется их концентрация. Как еще более неожиданно оказалось, изменения концентрации различных микроРНК свидетельствуют о большом числе различных патологий. И в клинической РНомике наступила «золотая лихорадка» по поиску «золотых» маркеров и предикторов (7-12).

Клиническая протеомика

Это идентификация и количественное определение всех индивидуальных белков, которые содержатся в образце (сыворотка крови, спинномозговая жидкость, моча, биопсия) и мониторинг изменения их концентраций. Протеом – совокупность всех белков, содержащихся в данном образце. Полный анализ протеома клеток, тканей, органов и биологических жидкостей проводится с помощью двумерного электрофореза с высоким разрешением и с последующей идентификацией индивидуальных белков за счет масс-спектрометрии. Это позволяет проанализировать до 10 000 индивидуальных белков в одном образце и зафиксировать изменения их концентраций.

Значительному прогрессу в области протеомики способствовали успехи масс-спектрометрического анализа пептидов. Масс-спектрометрия включает в себя четыре основных компонента. Во-первых, в ионном источнике масс-спектрометра из образца получают ионизированные пептиды или белки. Во-вторых, разделение ионов пептидов и белков происходит в анализаторе масс на основе их величины отношения массы к заряду (m/z). В-третьих, детектор ионов (времяпролетный масс-спектрометр) регистрирует отдельные ионы, с указанием значения m/z иона, количества ионов и времени пролета ионов от источника до детектора ионов.

Типичная последовательность операций при исследования в протеомике такова:

1) отбор образца (клетки, ткань, биологическая жидкость)

2) приготовление образца, лизис клеток, экстракция белков

3) изоэлектрофокусировка, электрофорез в 1-ом направлении

4) электрофорез в 2-ом направлении, полиакриламидный гель, додецилсульфат натрия

5) проявление белковых пятен на геле

6) анализ двумерной электрофореграммы (количество пятен, их расположение)

7) выделение участков геля, содержащих индивидуальные белковые пятна

8) расщепление индивидуальных белков трипсином прямо в геле

9) масс-спектрометрический анализ

а) масс-фингерпринтинг пептидов

б) определение аминокислотных последовательностей фрагментов индивидуальных белков

10) идентификация каждого белка и измерение его концентрации, документирование, обработка результатов

И, наконец, интерпретация полученных данных с помощью биоинформатики, анализ баз данных, в итоге, получение дифференциального профиля белков. С помощью этой техники уже открыты новые белковые маркеры и получены впечатляющие результаты в области кардиоваскулярной протеомики и онкопротеомики (13-18).

Кардиоваскулярная геномика, траскриптомика и протеомика

Повышать вероятность возникновения и развития атеросклероза могут мутации во многих генах. Такие мутации идентифицированы, например, в гене ALOX5AP, который кодирует белок активатор 5-липооксигеназы (5 lipoxygenase 5-LOX). Этот белок активирует синтез лейкотриена – липида, медиатора воспалительного процесса в стенках сосудов. Также повышают вероятность возникновения атеросклероза мутации в гене MEF2A (он кодирует фактор регуляции транскрипции в миоцитах); в гене Апо Е (кодирует аполипопротеин Е, входящий в состав Х-ЛПВП); в гене LTA (кодирует ген альфа-лимфотоксина) (17-18). Уже созданы базы данных по сотням белков протеома миокарда, уровни которых изменяются при хронических и острых сердечно-сосудистых патологиях. Обнаружено, что при таких патологиях возрастают концентрации т.н. белков теплового шока (heat-shock proteins – HSP), белков митохондрий, а также белков, вовлеченных в генерирование энергии. Диагностически важные белки кардиопротеома классифицируются так:

1) белки, связанные с энергией и метаболизмом

2) белки, индуцируемые стрессом

3) белки, обеспечивающие контрактильные функции и формирование цитосклета (19-20)


Весьма перспективным оказался мониторинг динамики протеомов биопсии миокарда, взятых до и после хирургического вмешательства. Обнаружено более 100 кардиоспецифических белков, уровни которых значительно изменяются при дилятационной кардиомиопатии.

Практически при всех формах сердечной недостаточности ее начальная стадия – это компенсаторная адаптация сердечной ткани к патологическим изменениям, в частности, гипертрофия левого желудочка. Довольно часто в таких случаях электрокардиография, клинические и гемодинамические показатели недостаточно адекватно отражают переход от патологии к норме. Однако возвращение к норме при вентрикулярном ремоделировании может быть эффективно достигнуто при мониторинге кардиопротеома (21).

Наиболее обещающими маркерами в кардиопротеомике могут быть тропонины, изоформы альфа-1-фибриногена, изоформы аполипопротеина А-1, С-реактивный белок и др.

Полагается, что кардиопротеомная техника станет незаменимой при сердечно-сосудистой хирургии. В передовых клиниках хирурги уже сейчас читают кардиопротеомы так же уверенно, как кардиограммы и ангиограммы (22).

На рисунке – двумерный гель-электрофорез образца биопсии левого желудочка пациента, страдающего дилятационной кардиомиопатией, перенес трансплантацию сердца. Изоэлектрическое фокусирование в диапазоне pI – 3-10, диапазон молекулярных масс белков от 15 до 100 кДа. На геле приблизительно 600 белков, которые были идентифицированы масс-спектральным анализом (22).

Транскриптомика и протеомика плазмы крови

Сколько всего индивидуальных белков в плазме крови? Какие новооткрытые белки плазмы могут иметь диагностическое значение? Когда и как изменяются их уровни?

Проект «Протеом Плазмы Крови» (ППК) был начат в 2002 году. По дерзости и масштабности ППК можно сравнить проектом «Геном человека». В реализации ППК участвуют 35 лабораторий в 13 странах. На первой стадии проекта была создана аннотированная база данных 3020 белков плазмы крови человека – www.bioinformatics.med.umich.edu/hupo/ppp ; www.ebi.ac.uk/pride . Она содержит информацию об:

1) идентификации каждого белка

2) его концентрации и стабильности

3) об особенностях его масс-спектрального анализа и др. (23, 24)

На второй стадии проекта было идентифицировано уже 9504 белка (на основе масс-спектрометрической идентификации одного или двух пептидов каждого белка) и 3020 белков (при идентификации двух и более пептидов, что более точно). 889 белков плазмы идентифицированы с достоверностью в 95%. Следующий этап – построение протеомов плазмы, характерных для различных патологий и формулировка международно согласованных их диагностических показателей (25,26).

Протеомика гемостаза

Протеомика тромбоцитов – быстро развивающееся направление. Уже обнаружены ранее неизвестные белки тромбоцитов, быстро идет расшифровка механизмов, приводящих к нарушениям коагуляции. В ранних исследованиях протеомов тромбоцитов было обнаружено, что при активации они секретируют 82 белка. Затем при использовании тромбоцитов, стимулированных тромбином, было установлено, что секретОм (секретируемый протеом) тромбоцитов – это боле 300 белков, и только 37% из них были известны ранее. 35% белков, секретирируемых тромбоцитами, секретируются также и другими клетками. 28% белков секретома тромбоцитов обнаруживаются в местах атеросклеротических повреждений. Эти работы привели к идентификации новых мишеней для новых лекарственных препаратов – это секретогранин III, циклофилин А, а также, калуменин и пролили свет на возможные механизмы адгезии тромбоцитов, способствующие развитию атеросклероза (27).

Транскриптомика и протеомика кровообращения

Циркулирующие в кровотоке моноциты способствуют развитию воспаления в стенках артерий, что приводит к атеросклерозу. Анализ транскриптома моноцитов неожиданно показал, что у пациентов, которые перенесли коронарную реваскуляризацию, повышен уровень экспрессии белка онкогена FOS (может вызывать остеосаркому Финкеля-Бискиса-Джинкиса). Что принципиально, корреляция между повышенным уровнем экспрессией гена FOS и реваскуляризацией была выше, чем корреляция между реваскуляризацией и уровнем «золотого» маркера атеросклероза – С-реактивного белка (28).

Онкогеномика, онкотранскриптомика, онкопротеомика

Обнаружены маркерные гены, активирующиеся на ранних стадиях онкогенеза и соответствующие им маркерные белки. Найдены маркеры, позволяющие проводить молекулярную классификацию опухолей, обнаружены предикторы метастазирования, предикторы ответа на терапию, маркеры, позволяющие прогнозировать развитие различных онкозаболеваний. Основные задачи онкопротеомики таковы:

1) построение протеомов и анализ их динамики при возникновении и развитии различных опухолей

2) идентификация путей передачи клеточных сигналов, приводящих к онкогенезу (см. также раздел «ОнкоРНомика»)

3) идентификация маркеров для диагностики онкозаболеваний и для мониторинга ответа опухоли и организма на хирургическое вмешательство и на разные типы терапии

4) определение иммунного ответа на онкогенез (29-35)

Весьма интересны данные по изучению геномики и протеомики белка р53 – супрресора опухолей, а также белков, с ним взаимодействующих.

ИнтерактОм – комплекс всех белков, взаимодействующих с данным белком. Мутации в гене белка р53 весьма часто приводят к канцерогенезу. Но при острых амилоидных онкозаболеваниях у 90% пациентов обнаруживается нормальный, а не мутантный ген р53. Интерактом белка р53 позволил выявить все белки, с которыми он взаимодействует, установить цепи передачи внутриклеточных сигналов, приводящих к злокачественному росту и к устойчивости к химиотерапии (36). Основная проблема во внедрении онкопротеомики в практику – сложность обучения онкологов чтению карт онкотранскриптомов и онкопротеомов.

ОнкоРНомика

Как уже говорилось, одно из самых сенсационных открытий в молекулярной биологии, сделанных в конце XX века – обнаружение микроРНК (см. раздел «РНомика»). На данный момент у человека идентифицировано около 400 генов, кодирующих разные микроРНК. Скорее всего, их список будет возрастать. Интерес к ним крайне высокий. Как показали и продолжают показывать совершенно неожиданные результаты последних лет, изменения в синтезе микроРНК сильно связаны с возникновением, прогрессированием и метастазированием злокачественных опухолей. Часть микроРНК при этом сверхсинтезируются. Синтез других падает. Некоторые исследователи даже полагают, что именно нарушение регуляции синтеза микроРНК, которые в свою очередь, как отмечалось, являются регуляторами синтеза белков – если не первопричина онкогенеза, то, по крайней мере, одна из главных причин (37-41).

Более 50% генов, кодирующих известные микроРНК человека, расположены в областях хромосом, связанных с онкогенезом. Некоторые микроРНК могут индуцировать онкогенез. К этому приводит повышение их синтеза. Другие микроРНК проявляют себя как супрессоры опухолей – подавляют неконтролируемую пролиферацию.

Например, микроРНК mir-17-92 в случае сверхсинтеза проявляет себя как онкоген, подавляя активность гена, который, в свою очередь, должен обеспечивать синтез белка – супрессора опухолей или белка, стимулирующего апоптоз («запрограммированную смерть») раковых клеток. А сниженный синтез некоторых микроРНК, например, микроРНК let-7, проявляется как действие опухолевого супрессора, способного ингибировать онкогенез за счет инактивации белков, вызывающих деление клеток (42). Отсюда и название микроРНК, связанных с онкогенезом – oncomirs (oncogenic micro RNA) (43).

С помощью онкоРНомики идентифицирован, в частности, комплекс микроРНК. который позволяет однозначно дифференцировать рак поджелудочной железы и доброкачественные опухоли этого органа. В этот комплекс входят около 100 различных микроРНК. Их содержание в опухолях поджелудочной железы в 30-50 раз выше нормы. Ожидается, что открытие этих микроРНК не только повысит возможности ранней диагностики рака поджелудочной железы, но и, возможно, ляжет в основу создания препаратов, ингибирующих их активность и тем самым подавляющих развитие опухолей поджелудочной железы (44). В другом исследовании различные специфические профили около 100 микроРНК были обнаружены в нормальной поджелудочной железе, при панкреатите и при раке поджелудочной железы. Эти профили позволяют проводить четкую дифференциальную диагностику указанных патологий (45). Кроме того, в опухолях рака молочных желез идентифицированы 4 типа микроРНК с особо резко измененными концентрациями, что, в свою очередь, оказалось связанным повышенной пролиферацией и инвазивностью клеток опухоли (46).

Повышенные уровни микроРНК miR-103 и miR-107, сопровождающиеся исчезновением микроРНК miR-155, позволяют проводить дифференциальную диагностику опухолей эндокринных желез и ацинозных опухолей. Повышенный синтез микроРНК miR-204 связан с инсулиномами и коррелирует с повышенным уровнем инсулина, регистрируемым иммуногистохимическими методами. А сверхсинтез микроРНК miR-21 сильно связан с образованием метастазов в печени (47).

Давно известно, что хромосомы злокачественных клеток характеризуются высоким спектром структурных аномалий, которые располагаются не случайным образом, а в специфических точках хромосом и тем самым представляют собой маркеры для цитологической диагностики. Как оказалось, в таких «горячих точках» хромосом весьма часто располагаются гены, кодирующие микроРНК. Экспрессия этих генов в таких случаях сильно нарушена – повышена для одних микроРНК либо понижена для других. Работы по идентификации подобных РНК и по выяснению их связи с локализаций структурных аномалий хромосом и с различными типами злокачественных опухолей – одни из самых перспективных (48). Уже идентифицировано 7 микроРНК, гены которых расположены кластером в области хромосомы, которая амплифицирована (многократно повторена) в лимфомах и в некоторых солидных опухолях. Такая амплификация, как правило, ведет к повышенной экспрессии генов (49).

Вопросы о том, как именно и какие именно стрессогенные факторы вызывают онкогенез, обсуждаются очень давно. В модельных опытах с использованием культур клеток показано, что при стрессогенных воздействиях (арсенат натрия, дефицит фолата) происходит глобальное повышение синтеза микроРНК, приводящее к нарушению нормальной сбалансированности их синтезов. Не исключено, что подобные процессы могут происходить и in vivo (50).

Однако применение микроРНК перспективно не только для диагностики. Предполагается, что введение в раковые клетки синтетических или природных РНК, предназначенных для избирательного подавления патологических повышенных уровней онкомикроРНК – весьма перспективный метод молекулярной терапии злокачественных заболеваний. Работы в этом направлении ведутся весьма интенсивно (51). Ожидается, что в 2010 году мировой рынок терапевтических препаратов, созданных на основе микроРНК, составит 3,5 млрд долл, а в 2015 – 10,5 млрд долл. (52).

Ренальная траскриптомика и протеомика

Уже достигнуты значительные успехи в обнаружении в тканях почек, полученных с помощью биопсии, в сыворотке крови и в моче новых маркеров, свидетельствующих о ренальных заболеваниях, о хронической и острой почечной недостаточности и их динамике. Эти маркеры способны обеспечивать дифференциальную диагностику ренальных патологий, мониторинг их терапии и мониторинг эффективности трансплантации почки (53). В предварительном, но уже весьма впечатляющем списке потенциальных маркеров почечных патологий представлены белки цитосклета, протеиназы, ингибиторы протеиназ, ферменты метаболизма, белки, связанные с апоптозом, белки процессов окисления-восстановления, белки, связывающие кальций, белки-транспортеры, сигнальные белки, белки, индуцируемые стрессом и др. (54).

Эндокринная транскриптомика и протеомика

Различные эндокринные клетки синтезируют разные спектры как кодирующих РНК, так и микроРНК. Весьма интенсивно ведутся работы по транскриптомике и протеомике всех эндокринных органов, как в норме, так и при патологиях. Результаты регулярно поступают в базу данных «Омнибус Экспрессии Генов» (Gene Expression Omnibus – GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ) (55). Цель эндокринной транскриптомики и протеомики: установить цепь молекулярных событий, от индукции синтеза гормона до реализации его действия в норме и при патологиях, обнаружить мутации, влияющие на эти процессы и разработать методы идентификации таких мутаций, применимые в лабораторной практике (56). Уже проводится идентификация всех РНК, изменение синтеза которых свидетельствует о злокачественных заболеваниях эндокринной системы (57-60). В 2002 г было идентифицировано около 400 генов, кодирующих рецепторы, связанные с различными G-белками и взаимодействующие с гормонами (61). Весьма перспективен транскриптомный и протеомный мониторинг результатов гормональной терапии многих онкологических заболеваний. При разработке методов мониторинга гормональной терапии эстроген-зависимого рака груди был установлен комплекс из 138 генов, активность которых изменяется в ответ на действие эстрогена (62).

На эндокринную активность может негативно влиять большое количество синтетических (антропогенных) и природных соединений, встречающихся в окружающей среде. Такие соединения, называемые эндокринными разрушителями (endocrine disrupters) весьма различаются по структуре и по своему действию. Их идентификация и выяснение механизма их действия с помощью токсигеномики считается весьма актуальной задачей (63-64).

Перинатальная транскриптомика и протеомика

Ее задачи – путем анализов транскриптомов и протеомов амниотической жидкости и находящихся в ней отшелувшихся клеток плода, а также материнской и пуповинной крови, определять риск спонтанных абортов и патологий развития плода (наследственных, врожденных и др.). (65-67)

Аллергопротеомика

Это анализ протеомов IgE антител, в особенности мониторинг изменения IgE протеомов при патологиях. Он уже успешно используется диагностики аллергических патологий и астмы (68-69).

Геномика, транскриптомика и протеомика стресса

Какие гены наиболее подвержены стрессам? Что при этом происходит в цепи событий от синтеза РНК до действия кодируемых ими белков? Как и когда кратковременный стресс приводит к острым или хроническим патологиям? Согласно общепринятой точке зрения, стресс – это координированные физиологические процессы, направленные на поддержание динамического равновесия в организме в стрессовых условиях. Стресс включает особые метаболические, физиологические и поведенческие механизмы, восстанавливающие гомеостаз. Уже проведены работы по исследованию транскриптома лейкоцитов периферической крови пациентов, страдающих депрессией (70).

Нейрогеномика, нейтротраскриптомика и нейропротеомика

Это транскриптомика и протеомика тканей, сыворотки крови и спинномозговой жидкости в норме и при нейропатологиях (71-72). Ранее было показано, что различные типы повреждений головного мозга у крыс приводят к различным изменениям в профилях транскриптомов в периферической крови. Позже эксперименты по определению транскриптомов и протеомов сыворотки крови показали, что существуют высокочувствительные и высокоспецифические их профили, предсказывающие ишемические инсульты. Также в крови обнаружены специфические профили транскриптомов и протеомов, характерные для синдрома Дауна, нейрофиброматоза, бугорчатого склероза, хореи Гентингтона, множественного склероза, синдрома Туретта и др. (73). Анализ транскриптома и протеома спинномозговой жидкости выявил, что мутационные повреждения генов, кодирующих предшественник амилоидного белка, а также белков пресенилин 1 и пресенилин 2, повышают вероятность развития болезни Альцгеймера (БА). Обнаружено несколько патогенетических путей возникновения БА, включающих нарушения процессинга предшественника амилоидного белка, деградацию бета-амилоида, нарушение процессов фосфорилирования белков, липидного метаболизма, протеолиза, процесса самосборки белков и др. (74). Весьма показательны результаты изучения протеомов спинномозговой жидкости пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, синдромом Дауна, болезнью Пика, шизофренией, болезнью Паркинсона. Уже идентифицировано около 330 белков, уникальных для нейродегенеративных и психиатрических нарушений. Эти белки участвуют в метаболизме, в формировании цитоскелета, в передаче внутриклеточных сигналов, детоксикации и др. (75). Известные белки, вовлеченные в нейродегенеративные заболевания – это нормальный tau-белок, бета-амилоидный белок 1-42, синаптические белки, белок-предшественник амилоидного белка, аполипопротеин Е (apoE). С помощью методов протеомики установлено, что при болезни Альцгеймера (в отличие от других нейродегенеративных заболеваний) в спинномозговой жидкости наблюдаются низкие уровни амилоидного белка 1-42 и высокие уровни tau-белка и его фосфорилированной формы (76). Обнаружено, что протеом спинномозговой жидкости, состоящий не менее чем из 250 белков, резко меняется при травматических повреждениях мозга. При таких травмах в 4 раза возрастают концентрации основных белков острой фазы, уровни изоформ гаптоглобина при этом повышаются 4 раза, а уровни простагландин-Д2- синтазы и цистатин-С-синтазы возрастают в 7 раз (77).

НейроРНомика

Как оказалось, микроРНК играют ключевую роль и в регуляции синтеза белков, необходимых для образования синапсов. Обнаружено и детально охарактеризовано большое количество микроРНК, локализующихся в местах синаптических контактов, реагирующих на внешние стимулы и, в результате, активирующих специфические ферменты (протеинкиназы), которые в свою очередь участвуют в обеспечении таких процессов, как память, обучение и др. (78-79). Похоже, что микроРНК вовлечены в процессы, связанные с умственной деятельностью, а нарушения синтеза таких микроРНК влияют на память и на показатели коэффициента интеллектуальности (IQ) (80-81).

Психиатрическая геномика, транскриптомика и протеомика

Это направление занимается выяснением того, какие именно мутации, какие изменения транскриптомов и протеомов характерны для психических расстройств (82-83). Определение транскриптомного профиля уже привело к открытию неожиданных связей между изменениями экспрессии определенных генов и психиатрическими проблемами. Обнаружено, в частности, что вызванные мутациями нарушения экспрессии генов GAD67 (кодирующего декарбоксилазу глютаминовой кислоты), RGS4 (регулятор сигнального белка G4), DTNBP1 (дисбиндин), NRG1 (нейрорегулин), GABRAB2 (рецептор А гамма-аминомаслянной кислоты) специфичны для шизофрении (84).

Неожиданно протеомика плазмы и спинномозговой жидкости пациентов, страдающих шизофренией, выявила изменения уровней аполипопротеинов, участвующих в метаболизме холестерина. Обнаружено снижение в плазме уровня аполипопротеина А-I, центрального белкового компонента Х-ЛПВП (85). В другой работе обнаружено, что при шизофрении наблюдается повышение уровней белков острой фазы (в т.ч. альфа-2-гаптоглобина, бета-гаптоглобина, предшественника В фактора комплемента) и понижение уровней аполипопротеина A-I и транстиретина – белка плазмы и спинномозговой жидкости, переносчика тироксина (86). Показано также, что при шизофрении в спинномозговой жидкости уровень аполипопротеина A-IV значительно снижен. Какую функцию этот компонент хиломикронов и Х-ЛПВП, принимающий участие в обратном транспорте холестерина, играет в ЦНС, неизвестно (87). Попутно отметим, что низкие уровни Х-ЛПНП в плазме связаны с болезнью Паркинсона (88). Уже обнаружено 165 генов, мутации в которых могут приводить к аутизму (89).

Транскриптомика и протеомика эмоциональных расстройств

Они устанавливают связь между патофизиологическими, биохимическими и генетическими маркерами биполярных эмоциональных расстройств. Такими маркерами являются моноаминовые трансмиттеры, некоторые гормоны, G-белки, вовлеченные в передачу внутриклеточных сигналов (90). Исследования по геномике с применением модельных систем (мыши) и сравнение полученных результатов с данными геномики эмоциональных расстройств человека выявили, что генами, нарушение функционирования которых ведет к таким расстройствам, являются DARPP-32 (дофамин-и цАМФ-регулируемый фосфопротеин, 32 кДА), PENK (препроэнкефалин) и TAC1 (тахикинин 1). Исследования по сравнительной геномике мыши и человека показали, что примитивные молекулярные механизмы, у мышей вовлеченные в возникновение и поддержание удовольствия или боли, в процессе эволюции стали играть у человека определяющую роль в реализации сложных ментальных функций, таких как разные эмоциональные состояния. Список генов, мутации которых вызывают эмоциональные расстройства, постоянно расширяется. Эти гены участвуют в обеспечении суточных физиологических ритмов, в образовании синапсов, связаны с функционированием миелина (91-92).

В спинномозговой жидкости пациентов с синдромом хронической усталости и с «болезнью войны в Персидском заливе» выявлено 20 белков, присутствующих у этих групп пациентов и не обнаруживаемых в контрольной группе. Два из них – альфа-1-макроглобулин и белок, сходный с предшественником амилодного белка (93). Тревожность, подверженность или устойчивость к стрессам – это генетически обусловленные характеристики, лежащие в основе многих психиатрических заболеваний. Обнаружено, что тревожность и подверженность стрессам обуславливается мутациями генов 5-HTT (серотониновый транспортер) и COMT (катехол-о-метилтрансфераза) (94).

Геномика личности

Хотя то, о чем будет говориться в этом разделе, строго говоря, не относится к лабораторной клинической диагностике, для полноты картины сказать об этом все же надо. Определяются ли генами и мутациями в них эмоциональные, ментальные и интеллектуальные особенности людей, не выходящие за пределы нормы? Первые доказательства этого были получены в многочисленных исследованиях когнитивных и психологических характеристик монозиготных (генетически идентичных) и дизиготных (генетически разных) близнецов в тех случаях, когда они были разлучены и росли в разных условиях окружающей среды. На уровне сравнения интеллектуальных и психологических характеристик таких близнецов было показано, что практически по всем когнитивным, ментальным, психологическим и поведенческим характеристикам монозиготные близнецы похожи друг на друга и на своих биологических, а не приемных родителей – вне зависимости от того, росли близнецы вместе или порознь, с биологическими родителями или с приемными.

Полагается, что генетически детерминированными являются даже такие, казалось бы, далекие от чисто биологических, характеристики как уровень интеллекта, самостоятельность и зависимость, активность и пассивность, мнительность и тревожность, экстравертность и интровертность, чувствительность или толерантность к стрессам, альтруизм и эгоизм, агрессивность и сексуальность. В значительной мере генетически детерминируемыми считаются и такие, казалось бы, социально обусловленные особенности человека, как политические предпочтения (консерватизм, либерализм, радикализм), как отношение к смертной казни (за или против), музыкальные вкусы (классическая, легкая или электронная музыка), патологическая азартность, алкоголизм, предпочтительный вид отпуска, маниакально-депрессивные психозы, шизофрения, криминальное поведение. Недавно в седьмой хромосоме были открыты гены «социального поведения», некоторые мутации которых приводят «к открытому поведению», к повышенной общительности (экстравертности) и доброжелательности, к повышенным лингвистическим способностям и к высокому уровню общих когнитивных способностей.

В данный момент список генов, непосредственно участвующих в программировании когнитивных характеристик человека, включает более 150 названий. Полагается, что существенное влияние на личностные характеристики оказывают мутации в генах, участвующих в кодировании метаболизма таких нейротрансмиттеров, как серотонин, дофамин, глутамин и др. (95). Весьма показательно открытие генов, особые мутации в которых характеризуют то, что принято называть национальным характером, или этнопсихологическими особенностями. Первым «молекулярным» прорывом в изучении геномики этнопсихологических особенностей стало обнаружение мутаций, программирующих «воинственность или миролюбие». Антропологи считают т.н. «архетипом воинственности» индейцев Южной Америки, в частности племя Яномамо (Yanomamo), члены которого регулярно встают на тропу войны. Это вызывается тем, что в гене, кодирующем рецептор нейротрансмиттера дофамина (DRD4), у этих индейцев очень часто встречается особая мутация 7R, которая делает их весьма агрессивными, возбудимыми, импульсивными и несговорчивыми. У бушменов и восточноазиатских фермеров («архетипы миролюбия») такая мутация встречается крайне редко. Другие типы мутаций в этом гене, как показала психиатрическая геномика, приводят к гиперактивности, к повышенной конфликтности, к постоянному поиску острых ощущений (96). Эмоциональная сдержанность и межличностная чувствительность, характерные для японцев, кодируются т.н. «короткими» мутантными формами гена транспортера нейротрансмиттера серотонина 5HTTLPR. Полагается, что высокая частота встречаемости этой мутации в японской популяции является результатом отбора, направленного на избегание исключения личности из социума (97).

В ближайшем будущем станет возможным быстрое секвенирование геномов конкретных лиц. Сейчас стоимость секвенирования генома индивида, занимающая около полугода, составляет около 20 млн. долл. Стратегическая цель – расшифровка генома за 1000 долл и за несколько дней – как ожидается, будет достигнута в течение ближайшего десятилетия и сделает эту процедуру, рыночный спрос на которую уже весьма велик, высоко рентабельной. Методы геномики личности, как считается, кардинально изменят облик не только медицины, но и общества в целом, сделав возможным прогнозирование не только развития многих заболеваний, но также и интеллектуальных, ментальных и поведенческих особенностей индивидов (98).

Транскриптомика и протеомика сна и бодрствования

Весьма интересны изменения в транскриптоме при сне, при бодрствовании, при лишении сна и при ходьбе. Полагается, что этот подход может быть перспективным для решения проблем, связанных с бессонницей (99).

Клиническая метаболомика

Метаболомика – построение глобального профиля концентрации всех метаболитов в данном образце. Основное направление работ – выявление метаболических изменений, характерных для инициации патологий и ее динамики, для закономерностей ответа метаболизма на терапию. Основные патологии, находящиеся в фокусе метаболомики – метаболический синдром, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, патологии печени. Метаболомика основана на применении спектроскопии протонного ядерного магнитного резонанса в сочетании с компьютерным анализом распознавания образов. Распознавание образов (паттернов) мультиплетной структуры спектров ЯМР – это новый инструмент изучения структуры и свойств органических соединений. Для лабораторной диагностики определяющее значение имеют спектры протонного ядерного магнитного резонанса сыворотки, спинномозговой жидкости и мочи (100-103). Метаболомика уже показала высокую эффективность при обнаружении врожденных и наследственных нарушений метаболизма, нарушений метаболизма, вызванных эндогенными и экзогенными факторами, при трансплантациях (до и после), при изучении токсичности лекарственных препаратов (токсикогеномика), реакций организма на лекарственные препараты (фармакогеномика), при определении индивидуальных особенностей реакции организма на различные пищевые продукты (нутриномика) (104).

Но как осмысливать данные метаболомики? Как и в какой степени соотносить полученные данные со сложнейшей общей картиной метаболизма человека? В начале 2007 года сообщено о создании базы данных и компьютерной модели, в которых впервые представлены все биохимические реакции, происходящие в организме человека и связи активностей всех генов с обменом веществ и последующей выработкой соответствующих белков, ферментов и метаболитов. Разумеется, карты отдельных метаболических циклов существовали и раньше, однако такая работа по глобальному обобщению проделана впервые. База данных, которая теперь будет постоянно пополняться, сегодня включает 3300 различных химических реакций. Для этого пришлось просмотреть около 1500 книг и огромное число научных статей, причем без помощи компьютера, поскольку глубина анализа составляла 50 лет, а тогда электронных публикаций еще не было. Биохимические реакции и их взаимосвязи описаны для каждого типа клеток организма. В компьютерную модель можно вводить различные исходные данные и на выходе получать результаты в виде концентрации тех или иных веществ. Для испытания системы были использованы 288 различных ситуаций, в частности, синтезы тестостерона и эстрогена, а также метаболизм жиров, поступающих в организм с пищей. Модель имеет общий характер, и сегодня использовать ее с учетом особенностей индивидов пока непросто (105).

Кардиоваскулярная метаболомика

Метаболомика сыворотки крови весьма точно диагностирует сердечно-сосудистые патологии и определяет их тяжесть. В частности, обнаружена высокая корреляция между определенным показателями метаболома и количеством стенозов в коронарных сосудах, а также корреляция между этими показателями и эффективностью терапии статинами (106).

Ренальная метаболомика


Изменение профилей метаболитов как сыворотки, так и мочи довольно точно локализует патологии в почках. Метаболомный мониторинг изменений, связанных с применением иммунодепрессантов и других препаратов, обеспечивает надежное прогнозирование процессов, связанных с гемодиализом и трансплантацией. В частности, метаболомика уже показала свою эффективность при мониторинге последствий, вызванных трансплантаций почки. Традиционно эти процессы контролируются с помощью мониторинга уровня сывороточного креатинина, выхода мочи, кровяного давления, определения уровня глюкозы и гистопатологии образцов биопсии. В целом с помощью метаболомики в сыворотке крови и в моче были обнаружены новые маркеры, которые позволяет более эффективно проводить мониторинг трансплантации почки, определять степень токсичности иммуносупрессивных препаратов, указывать на локализацию повреждения (107).

На рисунке – функциональный ЯМР-спектр мочи крыс. Разным цветом обозначены зоны, в которых располагаются спектральные биомаркеры, специфически характерные для различных патофизиологических состояний. Один ЯМР-спектр (одно измерение) дает информацию о большом количестве патологических процессов, обычно о сотнях типах заболеваний (108).

Психиатрическая метаболомика

Весьма информативными оказались исследования метаболома спинномозговой жидкости при шизофрении. Они выявили серьезные нарушения регуляции уровня глюкозы, характерные для этой патологии. Показательно, что у пациентов с шизофренией количество случаев диабета 2 типа составляет 16,8% , тогда как в среднем в популяции встречаемость диабета 2 типа – 2–3%. (109).

Клиническая липидомика

Это – важнейшее направление метаболомики. Нарушения липидного обмена связаны с такими заболеваниями, как атеросклероз, диабет, ожирение, болезнь Альцгеймера. Липидом – липидный профиль грубого липидного экстракта из образца – это масс-спектр, характеризующий липидный состав и концентрации всех индивидуальных липидов образца. Подход основан на комбинации жидкостной хроматографии и масс-спектрометрического анализа. Прогресс в липидомике достигнут благодаря разработке новых масс-спектрометрических подходов, в частности, методов «мягкой ионизации», таких как ионизация электрораспылением и матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация. В частности, успехи применения метода масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением способствовали развитию «струйной» липидомики (shotgun lipidomics) и практическому применению разделения компонентов внутри источника ионов в качестве стратегии применения двумерной масс-спектрометрии для изучения состава липидов биологических образцов (110).

Липидомика подразделяется на:

1) липидомику клеточной архитектуры и мембран (architecture/membrane lipidomics) и

2) липидомику медиаторов (mediator lipidomics)

С помощью липидомики строятся метаболические сети, в которых участвуют практически все липиды и медиаторы, являющиеся производными липидов. С помощью этого подхода уже установлено детальное строение мембран многих типов клеток, установлены механизмы активации провоспалительных цитокинов, происходящие за счет медиаторов, связанных с липидами (111, 112).

Клиническая нейролипидомика

Нарушения метаболизма липидов связаны с серьезными неврологическими патологиями, включающими биполярные расстройства и шизофрению, а также с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Неймана-Пика (Niemann-Pick). Нарушения регуляции липидов связаны также с повреждениями, вызванными ишемическим инсультом. Особенно большое значение имеет нейролипидромика спинномозговой жидкости (113).

Многомерная биология: перспективы для медицины и лабораторной диагностики

Научное значение многомерной биологии для медицины переоценить невозможно. Этот подход уже привел к выявлениию новых механизмов возникновения и развития многих патологий. В ближайшем будущем следует ожидать появление единой многомерной медицинской науки, раскрывающей детальные молекулярные механизмы конкретных патологий в цепи событий, включающих: «гены – РНК – белки – метаболиты – физиологические процессы – психиатрические и психические особенности – ментальные и интеллектуальные характеристики.

Что касается ценности «-омик» для лабораторной диагностики – это новые маркеры, которые уже открыты и обязательно будут открыты. Диагностическая ценность маркеров обычно зависит от трех показателей: чувствительности, специфичности и предсказательной способности. Как правило, между чувствительностью и специфичностью существует обратная зависимость. К сожалению, маркеры с идеальной специфичностью и чувствительностью очень редки. Но с другой стороны, причина почти всех патологий никогда не бывает единственной, чаще всего это неблагоприятное стечение многих отрицательных факторов. Возможным решением этой проблемы может стать разработка стандартных комплексов маркеров, которые будут давать достоверную предикторную и/или диагностическую информацию. Поскольку биология высоких измерений позволяет установить причинно-следственные в цепи: ген – РНК (кодирующая или микроРНК) – белок – метаболит, такие комплексы маркеров могут состоять из специфических олигонуклеотидов, белков и метаболитов (114).

Следующий этап – разработка для относительно широкого применения узкоспециализированных наборов для транскриптомики, протеомики и метаболомики, например, кардиопатологий, ренальных патологий, различных злокачественных заболеваний, разных биологических жидкостей и т.д. (реагенты, оборудование, инструменты, компьютеры, базы данных, программное обеспечение и др.).

Сейчас, как и раньше, в лечении участвуют трое: врач, болезнь и больной. Но скоро у врача может появиться сильный союзник – компьютерная модель больного. Появится возможность лечить одновременно больного и его компьютерную модель, построенную на основе геномики, транскриптомики, протеомики и метаболомики пациента и, по мере лечения, на основе мониторинга их динамики, корректировать и то, и другое

И станет тогда медицина XXI века предиктивной, превентивной и персонализированной: предсказывающей, предотвращающей и ориентированной не на борьбу с отдельными болезнями, а на четко и научно индивидуализированное лечение конкретного больного (114).

«И сказали они: построим себе город и башню, высотою до небес…» (Быт. 11:4).


Список литературы к статье В.В. Велькова «Многомерная биология XXI века и клиническая лабораторная диагностика» вы можете скачать в отдельном файле.


Автор: Вельков В.В.

ЗАО «ДИАКОН», 142292, г. Пущино, Московская область, проспект Науки, 5
www.diakon-diagnostics.ru

Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» http://www.cbio.ru/

Журнальная версия статьи опубликована в журнале «Химия и Жизнь» № 3-2007